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Title: Isolamento, purificação e caracterização parcial do fator quimiotático de neutrófilos liberado pela Leishmania infantum em cultura
Other Titles: Isolation, purification and partial characterization of a neutrophil chemotactic factor released by Leishmania infatum in culture
Authors: Oliveira Filho, Marcos Antônio
Keywords: Leishmania spp.;Leishmaniose;Quimiotaxia;Neutrófilos;FPLC
Issue Date: 3-Dec-2015
Publisher: Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Citation: OLIVEIRA FILHO, Marcos Antônio. Isolamento, purificação e caracterização parcial do fator quimiotático de neutrófilos liberado pela Leishmania infantum em cultura. 2015. 28f. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Engenharia Química), Departamento de Engenharia Química, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2015.
Portuguese Abstract: O complexo de doenças conhecido como Leishmaniose é ainda um problema de saúde pública em muitas áreas do mundo com mais de um milhão de casos de todas as formas clínicas reportados anualmente. Ainda existem muitas dúvidas acerca de como o parasita interage com as células de seu hospedeiro mamífero, incluindo neutrófilos e células derivadas de monócitos. Estudos anteriores relataram que neutrófilos são as primeiras células a migrarem em direção ao sítio de infecção de Leishmania. Além disso, neutrófilos podem atuar no auxílio da infecção, pois eles agem como “células escudo” diminuindo a capacidade de detecção do parasita pelas outras células de defesa. Os objetivos desse estudo são identificar, purificar e caracterizar moléculas liberadas pelos promastigotas da Leishmania em cultura que apresentem possíveis compostos promotores de quimiotaxia para neutrófilos. No intuito de caracterizar esse fator quimiotático, L. infantum foi cultivada em meio HOMEM por 144 h e o sobrenadante foi coletado (MLP cond) e tratado a diferentes temperaturas, tripsina e exclusão de tamanho. Moléculas menores que 10 kDa mostraram uma atividade comparada com o controle positivo (MLP cond). Quando as amostras foram fracionadas em diversos tamanhos e postas juntas novamente, observou-se um aumento de atividade. Quando as frações foram tratadas a 100 °C por 10 min, a atração de neutrófilos dobrou comparada a amostras sem tratamento térmico. As amostras foram também tratadas com tripsina e inibidores de tripsina e continuaram com a mesma atividade quimiotática (P> 0,05, em análise one way ANOVA). Esses resultados sugerem que a quimiotaxia pode ser devido a mais de uma molécula e de diferentes tamanhos. Fast protein liquid chromatography (FPLC) foi também usada na purificação do fator quimiotático. Uma coluna de troca aniônica (HiTrap Capto DEAE 1 mL, General Electric) foi utilizada e o pH de operação foi estabelecido a 8,0. As frações foram coletadas e testadas para atividade, mas resultados inconclusivos foram obtidos. Como se trata de uma pesquisa ainda em andamento, passos futuros foram sugeridos em prol de o objetivo ser atingido.
Abstract: The complex of diseases that comprehends Leishmaniasis is still a public health issue in many areas of the world with more than 1 million cases of all clinical forms reported yearly. There is a lot to be understood how the parasites interact with the mammalian cell host, including neutrophil and monocyte derived cells. Previous studies reported that neutrophils were the first cells to migrate towards the site of Leishmania infection. Indeed, neutrophils can actually help the progression of Leishmania infection, because they act as “shield cells” decreasing the capability of other defense cells to detect the parasites. The objectives of this study are to identify, purify and characterize molecules that are released by Leishmania promastigotes in culture which present potential chemotactic features for neutrophils. In order to characterize this chemotactic factor, L. infantum was cultured in HOMEM medium for 144 h and the supernatant was collected (MLP cond) and treated with different temperatures, trypsin, size exclusion. Molecules smaller than 10 kDa showed activity compared to the positive control (MLP cond), when the size fractionated samples were pulled back together, there was a higher activity. In addition, fractions treated at 100ºC for 10 min had a 2-fold increase in activity compared to no heat treatment. Samples were treated with trypsin and trypsin inhibitor still remained with the same chemotactic activity (P>0.05, in one way ANOVA statistical analysis). These results suggested that the chemotaxis can be due to more than one molecule of different sizes. FPLC was also used to purify the chemotactic factor. An anionic exchanger column (HiTrap Capto DEAE 1mL, General Electric) was used and the pH of operation was set at 8.0. The fractions were collected and tested for activity, but inconclusive results were obtained. As the research is still in progress, future steps were suggested to achieve the objectives.
URI: http://monografias.ufrn.br/jspui/handle/123456789/1502
Other Identifiers: 2011048033
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